《临床研究与药学杂志》2018年第1卷第1期

柠檬酸杆菌种类的表型鉴定和抗生素谱。

¹阿孔巴阿科科，阿孔巴阿贾辛大学微生物系

²国王大学生物科学系，尼日利亚奥德奥姆

*通讯作者:

Oludare Temitope Osuntokun
微生物学系
阿贾辛大学
Akungba Akoko
尼日利亚
电话:08063813635;08056096672
电子邮件:osuntokun4m@gmail.com

接受日期:二零一七年十二月三十日

引用:Osuntokun OT, Jemilaiye TA, Thonda AO。的表型鉴定和抗生素谱枸橼酸杆菌属物种。中华临床医学杂志，2018;1(1):1-6

摘要

对患者使用抗菌药物对感染存活率有重大影响。然而，发展和变化的模式抗菌素耐药性造成威胁并引起对现有抗生素政策的审查或对新抗菌剂的需求。本研究旨在确定柠檬酸杆菌的表型鉴定物种柠檬酸杆菌的抗生素谱物种从伊巴丹大学学院医院(UCH)分离。2016年12月至2017年3月，从使用联合医院实验室服务的患者中回收临床分离标本20例。然后使用氧化酶试纸和microbacact™12A和24E (Oxoid, UK)鉴定试剂盒进行初步验证试验，以鉴定分离物为柠檬酸杆菌。采用几种常用抗生素对鉴定出的柠檬酸杆菌分离株进行药敏试验(抗菌谱)，并测定哌拉西林/他唑巴坦对柠檬酸杆菌的最低抑菌浓度(mic)。氧氟沙星对4株柠檬酸杆菌均有抑制作用(100%)，抑制区直径范围为18 ~ 25 mm。紧随其后的是哌拉西林/他唑巴坦，对4株分离菌中的3株(75%)有活性，抑制区直径范围为26 ~ 40 mm。2株(50%)对复方新诺明(24 mm和30 mm)和亚胺培南(18 mm和35 mm)敏感。所有菌株均对头孢菌素(头孢他啶、头孢噻肟和头孢西丁)、氯西林、奥西林、哌拉西林、美罗培南、制霉菌素及氨苄西林+克拉维酸联合用药耐药。MIC值较高，为100 ~ 110 μg/mL。这项研究强调了柠檬酸杆菌的流行物种在尼日利亚南部的临床样本和分离的柠檬酸杆菌物种的多重耐药性质。

关键字

表型鉴定，抗生素谱，枸橼酸杆菌属物种

介绍

对患者使用抗菌药物对感染存活率有重大影响。然而，抗菌素耐药性的演变和变化模式构成了威胁，并引起了对现有抗生素政策的审查或对新型抗菌素的需求。细菌抗微生物药物耐药性是一个全球性问题，由于制药管道中新的抗微生物药物数量不断减少，这一问题更加严重[1］．这是一个正在出现的公共卫生问题，特别是在非洲、亚洲和太平洋的发展中国家和新兴工业化国家的医院中[2，3.］．

在尼日利亚等发展中国家，抗菌素耐药性的蔓延是一个令人关切的问题，因为它危及传染病的管理，而传染病是这些国家发病率和死亡的主要原因[4，5］．目前关于影响撒哈拉以南非洲的传染病和耐药性的讨论大多局限于与新出现和重新出现的耐药生物体有关的紧迫问题。因此，抗生素耐药生物的可用治疗选择严重有限，因为这些生物经常表现出多重耐药表型。

过度使用抗菌素会产生耐药性的选择性压力。此外，医生开出的无效抗生素的经验性治疗和患者对抗生素方案的依从性差可能会导致突变和耐药性[6］．此外，在动物性食品中常规使用抗生素以促进其生长是另一个可能增加耐药性选择压力的方面[7，8］．菌株中出现抗生素耐药性的比率肠杆菌科和其他革兰氏阴性杆菌在世界上许多地方非常令人担忧，这是对医院成功治疗感染的主要威胁[9］．枸橼酸杆菌属属需氧、活动、革兰氏阴性杆菌肠杆菌科。枸橼酸杆菌属据报道，该物种可引起一系列感染，包括尿路感染、伤口感染(手术部位感染)、呼吸道感染、中耳感染、脑膜感染、骨髓炎、腹膜炎、心内膜炎和菌血症[10］．

导致人类感染的三种主要物种是C. freundii, C. koseri,c . braakii。那些倾向于枸橼酸杆菌属感染发生在新生儿(通常小于2个月大)和衰弱的老年人(≥65岁)或免疫功能低下的患者。许多枸橼酸杆菌属感染是医院获得性的，但也可以是社区获得性的。在医院环境中，柑橘杆菌可能占所有引起医院感染的肠杆菌科的3-6%。医院感染的重要性不仅在于它能够大大改变发病率和死亡率统计数据，还在于它的经济意义。医院感染在全球范围内构成了一个巨大的问题，因为医院所在地已被证明有利于传播枸橼酸杆菌属存在合适的病原体-宿主-环境关系引起的感染[5］．

的枸橼酸杆菌属物种正在成为具有抗生素耐药菌株的重要医院病原体，尽管频率较低[11］．有侵入性器械的患者更容易出现侵入性枸橼酸杆菌属感染与高死亡率有关，大多数患者死亡或消瘦枸橼酸杆菌属菌血症。高死亡率与枸橼酸杆菌属感染可能部分是由于无效的经验性抗生素治疗。

抗生素耐药性已显著增加枸橼酸杆菌属使得由这些病原体引起的感染难以治疗[12］．枸橼酸杆菌属物种通常对常规使用的抗生素有耐药性，如青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类和四环素类。头孢菌素是经验性抗生素治疗的主要组成部分，特别是在教学医院。滥用第三代头孢菌素导致了广谱β -内酰胺酶(ESBLs)的产生和多重耐药(MDR) [13］．耐多药菌株在美国越来越常见枸橼酸杆菌属Spp，其中临床分离物对多种抗生素具有耐药性的报道越来越多[14，15］．

材料与方法

使用的设备和材料

本研究使用的设备包括:高压灭菌器(LDZX-30FBS，英国)，培养箱(Genlab，英国)，烘箱(Gulfex Medical and Scientific，英国)，冰箱(Haier Thermocool，中国)，天平，热板，本生灯，层流罩。

本研究使用的材料包括:试管，烧杯，圆形烧瓶，接种环，无菌针和注射器，麦卡特尼瓶，手套，不吸水棉，铝箔，酒精(95%)，次氯酸钾溶液，纸带，培养皿，通用无菌瓶，无菌蒸馏水，Mueller Hinton agar (Oxoid, UK)， Microbact™12A和24E鉴定试剂盒(Oxoid, UK)，以及一些选定的抗生素盘(Oxoid, UK) (图1)．

图1:使用microbacact™12A试纸及其报告表格。

样品采集和分离细菌鉴定

2016年12月至2017年3月，在伊巴丹大学学院医院(UCH)的实验室服务中，从患者中分离出20例非重复非重复临床标本。然后将分离株用准备好的营养琼脂倾斜转运到Adekunle Ajasin大学微生物实验室进行进一步的微生物学分析。从痰、血、尿、便中分离出临床分离株。初步确认试验确定分离株为枸橼酸杆菌属然后根据制造商的说明，使用氧化酶试纸和microbacact™12A和24E (Oxoid，英国)鉴定试剂盒进行检测。然后将回收的分离株制备并代培养到营养琼脂斜面中，并在-4°C冷藏以备进一步使用(图2)．

图2:使用microbacact™24E试纸及其报告表格。

抗菌谱剖面

进行抗生素敏感性试验以确定所鉴定的表型耐药模式枸橼酸杆菌属spp分离株与尼日利亚一些常用抗生素的相关性。本试验采用Kirby-Bauer圆盘扩散法在Mueller-Hinton琼脂(CM337-Oxoid, UK)上进行，使用10⁴生理盐水稀释24小时肉汤培养(图3)．结果根据临床实验室标准研究所(CLSI, 2016)指南进行解释，并以毫米为单位测量和记录抑制区直径。抗生素的选择是根据其对细菌的作用机制以及尼日利亚三级保健机构常用抗生素的原则作出的。标准抗生素盘(Oxoid，英国)，其浓度为头孢他啶(30 μg)、头孢西丁(30 μg)、头孢噻肟(30 μg)、阿莫西林+克拉维酸(30 μg)、复方新诺明(25 μg)、氧氟沙星(5 μg)、亚胺培南(10 μg)、哌拉西林/他唑巴坦(110 μg)、氯西林(5 μg)、奥西林(1 μg)、哌拉西林(100 μg)、美罗平(10 μg)、万古霉素(30 μg)、替柯普兰宁(30 μg)、制霉菌素(100 IU) (图3)．

图3:显示一种柠檬酸杆菌分离物的抗生素谱图。

筛选ESBL生产者

的枸橼酸杆菌属根据临床实验室标准协会(CLSI, 2016)指南，对头孢菌素耐药的spp分离株进行进一步处理，采用联合圆盘增强法检测ESBL。将头孢噻肟(30 μg)、头孢他啶(30 μg)和头孢噻肟(30 μg)分别置于距阿莫西林+克拉维兰酸(30 μg)组合盘20mm的Mueller-Hinton琼脂板上，接种24小时肉汤培养的分离菌，用生理盐水稀释至10⁴接种密度。然后在16-24小时的孵育后读取结果。

最小抑制浓度(MIC)

根据临床实验室标准研究所(CLSI, 2016)，使用琼脂稀释法进行最低抑制浓度(MIC)。对不同浓度哌拉西林/他唑巴坦进行了临床对照试验枸橼酸杆菌属对抗生素敏感的分离株直径≥18 mm。将24小时的肉汤培养接种于含有不同浓度哌拉西林/他唑巴坦的Mueller-Hinton琼脂板上，在37℃的适宜条件下有氧培养24小时。

结果

所收集的临床样本中分离株的分布和获得样本的患者概况见表1。分布表明，20株革兰氏阴性分离菌中，4株(20%)属于革兰氏阴性枸橼酸杆菌属物种(C。freudii3, C。坂-1)，其中50%从尿液样本中回收。分离株的抗生素谱图枸橼酸杆菌属对某些选定抗生素的SPP表示为表2。本研究的抗生素谱明确显示对氧氟沙星的敏感性最高(100%)，其次是哌拉西林/他唑巴坦(75%)和复方新诺明(50%)。

表1。分离株在临床样本中的分布和获得样本的患者的概况。

表2。柠檬酸杆菌对常用抗生素的抗菌谱(单位:mm±sem)。

ESBL生产商的筛选结果见表3。分离株对糖肽的表型抗性模式见表4。结果对泰可普宁和万古霉素的耐药率最高(100%)。哌拉西林/他唑巴坦对恢复的敏感菌株的最小抑菌浓度(MIC)枸橼酸杆菌属SPP在表5。

表3。柠檬酸杆菌分离株ESBL产生菌表型筛选(单位:mm±sem)。

表4。柠檬酸杆菌对糖肽的抗性表型分析。

表5所示。对哌拉西林/他唑巴坦敏感的柠檬酸杆菌的MIC模式。

讨论

本研究的目的是确定表型抗性枸橼酸杆菌属菌种及抗生素谱枸橼酸杆菌属伊巴丹大学附属医院分离种。本研究表明，在伊巴丹市大学附属医院(UCH)的20株临床分离株中，有4株(20%)被感染枸橼酸杆菌属物种(枸橼酸杆菌属freundii3,枸橼酸杆菌属坂崎-1)与1(25%)。这远远高于Khanna等人的报告。[14(4.70%)枸橼酸杆菌属但与Avinash等人的报告相似(每1000个临床样本中有25.1%)。这种高流行率可能是由于这些医院在处理病人时缺乏预防措施。大多数分离株来自尿液样本(50%)，其余50%来自痰液和耳拭子。这种低患病率枸橼酸杆菌属本研究的spp与Onoh RC等人的报告相似。16谁孤立了五个人?枸橼酸杆菌属从尿液样本中培养的共252株细菌中分离出SPP。Metri BC和Jyothi P [17报道说，像导尿这样的侵入性手术有助于细菌在膀胱中定居。宿主体内完整的免疫系统在一定程度上有助于防御病原体，但当患者免疫功能低下时，病情将是致命的。

惠特比的研究发现枸橼酸杆菌属12%的急性感染。一些研究报告称枸橼酸杆菌属物种似乎是引起尿路感染的贡献生物之一[17，18］．抗生素谱枸橼酸杆菌属spp (表2)显示所有分离株的抗性水平都非常高。在这项研究中，氧氟沙星对这四种细菌都有活性枸橼酸杆菌属分离株(100%)，抑制区直径为18 ~ 25 mm。紧随其后的是哌拉西林/他唑巴坦，对4株分离菌中的3株(75%)有活性，抑制区直径范围为26 ~ 40 mm。2株(50%)对复方新诺明(24 mm和30 mm)和亚胺培南(18 mm和35 mm)敏感。的枸橼酸杆菌属SPP也表现出对β-内酰胺类抗生素的耐药性。分离株对头孢菌素的耐药率较高。4株菌株均对头孢西丁和头孢噻肟耐药(100%)，对头孢他啶耐药3株(75%)。所有菌株对氯西林(100%)、氧苄西林(100%)、哌拉西林(100%)及氨苄西林+克拉维酸(100%)、美罗培南(100%)、制霉菌素(100%)联合耐药。枸橼酸杆菌属除了氧氟沙星外，阪崎对所有使用的药物都表现出极端的多药耐药性。抗生素的过度处方、缺乏遵守、在农业中广泛使用抗生素、卫生保健机构感染控制不力、卫生和环境卫生条件差以及没有发现新的抗生素，这些都与耐药菌株的发展有关。抗生素耐药性的另一个可能原因是药品质量差，这是尼日利亚卫生保健系统面临的主要威胁。在这项研究中，枸橼酸杆菌属freundii是最常见的被分离的物种，在其他研究中也是如此[14，18］．结果发现，所有分离株均不产生ESBL (表3)，这与Yusha 'u(2010)报告的25%(1 / 4)的发生率不同。据报道，ESBL生产者的发生和分布在肠杆菌科每个国家和医院都不一样。然而，这些表现出的阻力枸橼酸杆菌属SPP分离株可能是由于β-内酰胺酶产生以外的其他耐药机制。如图所示表5，哌拉西林/他唑巴坦的MIC值与枸橼酸杆菌属分离株含量很高(分别为100 μg/mL和110 μg/mL)。这可能是一个提示，如果不采取适当的抗生素给药措施，这些分离株可能对这些联合抗生素产生耐药性。

这项研究的优势在于广泛的人群，包括住院和门诊患者样本，反映了循环耐药性，以及广泛的抗生素使用范围，涉及几乎所有类别的抗生素。然而，也有一些限制。这项研究的样本量相对较小。这是由于发病率低枸橼酸杆菌属来自两所三级卫生机构的分离株中的物种，这也已在全球范围内报告。对除氨基糖苷类、四环素类和大环内酯类外的少数抗生素组进行了药敏试验。

未来研究的进一步领域是这些抗生素耐药性的遗传多样性和特征枸橼酸杆菌属菌株。这将使我们能够确认这些菌株表现出的抗性机制以及负责其抗性的各种基因。

结论

枸橼酸杆菌属物种正在成为重要的耐药病原体。在这项研究中，枸橼酸杆菌属freundii是尼日利亚南部伊巴丹大学教学医院(UCH)分离到的最常见物种。多药耐药性相当高枸橼酸杆菌属物种。这些多重耐药菌株大多对哌拉西林/他唑巴坦联合用药敏感。在选择用于治疗患者的抗生素时需要更加谨慎枸橼酸杆菌属感染，避免治疗失败。这种细菌在任何时候都可能对这些药物产生耐药性，因此，应避免不加区分、不充分和预防性地使用这些抗生素。严格执行病房及设备消毒、对定植病人的屏障防护、手部卫生等感染控制措施，防止病原体传播。在尼日利亚这样资源匮乏的国家，抗生素谱是一种成本效益高、简便和快速的分型工具，在那里分子分型工具不容易获得。只有在紧急情况下，才能根据该机构的抗生素敏感性模式对患者进行经验性治疗。

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